对于研究人员在制药，特别是生物制药的预配方开发阶段所面临的诸多分析难题中，粘度的测量尤其重要。能够在生物制剂研制的早期准确确定粘度，对于后续研制阶段中降低失败候选样品数量起到关键的作用。对于样品量极少的贵重样品，依据配方条件（通常是浓度很高的情况下）进行测量时，测量的难度尤其巨大。
常规的粘度测方法在上述情况下往往不能进行。除了样品量很少外，人们越来越多地需要在同一只小样本上进行高通量多参数的自动化测量。本文介绍了紫外区域成像技术在生物制剂粘度和分子大小的自动测量方面的应用及其相比于传统技术所具备的优势。
开发可注射的生物疗法
在生物疗法的开发中，药物的疗效和患者的体验是十分关键的因素。由于大多数生物分子都无法经受胃肠道路线的严酷环境，通常会采用静脉注射、肌肉注射或皮下注射的给药方法。活性分子的浓度必须相对较高，通常超过100 mg/mL，以补偿其较短的血浆半衰期。最大的难题之一是，如何开发可以低剂量注射的高浓度配方，以达到最大的有效性，并提高患者舒适度。因为在生物制药中，高浓度往往意味着高粘度以及肠外给药带来的潜在问题。
生物制剂配方是一个极具吸引力的领域，而对这个领域的认识以及可以支持其发展的分析工具体系的发展也十分迅速。然而，这其中有一个测量方面的难题直到现在才完全得到解决，即怎样在开发的早期阶段对低粘度特性或不符合规定粘度范围的配方进行筛选。包括旋转流变仪和标准毛细管粘度计在内的传统粘度测量技术不太适合生物制药早期开发的需求，其原因是必须用极少量的珍贵样品进行多种测试，而这类测试对微量分析、高通量和样品回收的要求都非常高。现在有一种新的方案可以解决上述这个测量难题，它是将紫外区域成像与微毛细管粘度计相结合，为生物制药配方提供快速、高通量和非破坏性的粘度和分子大小测量。在开发过程的较早期阶段对粘度进行可靠测量，开启了挑选具有更好可注射性候选生物治疗制剂的可能性。
用紫外区域成像方法用于粘度和尺寸测量
在这一应用中，紫外区域成像被用于监测紫外活性样品通过微毛细管过程中吸光率随时间变化的情况，这些样品包括蛋白质、多肽和其它含紫外发色团的分子等。长期以来，毛细管粘度计的检测方法是通过简单测定药物从端口到检测器的时间来确定样品粘度，但由于一直受进样时间误差的影响，容易导致随后的计算中出现重大错误。新的系统采用双通道毛细管设计，样品通过毛细管分先后两次流经紫外检测窗，从而可以准确检测样品两次经过窗口的时间，进而准确测得样品的粘度。对样品粘度和尺寸的分析都是基于两个窗口之间的时间变化而得出的。
在已知恒温恒压下，样品的粘度可以参比已知粘度的样品，通过检测样品两次经过UV 检测窗口之间的时间得到。样品检测可以通过使用UV 成像阵列，按照具体样品的吸收率范围，对样品进行一系列的单独快照来实现。用信号处理算法测定样品的粘度，并选取适当的时间位移，对前述快照的平均状态进行综合计算，再转换成精确的粘度、分子大小和浓度测量值。
测定依赖于特定分子的独特紫外吸收而不是其物理特性。这个特点使其能对极低的样品量进行测量——对粘度测量而言，样品体积小于10 微升；而对尺寸测量，样品体积则小于10 纳升。由于紫外分析技术对于样品没有伤害，因而可以对分析过的样品进行回收。与之相对，传统的流变技术虽然能测量蛋白质样品粘度，但同时对样品剪切变稀；在样品与空气接触的界面，剪切、蛋白吸附和变质的影响更加严重。
图2 对旋转流变仪与基于紫外区成像的粘度计进行了比较，结果表明两种技术在对样品的影响方面存在着明显差异。微毛细管分析技术观察不到剪切变稀现象，这表明在旋转流变测量中所发生的剪切变稀可能是由于空气-样本接触界面的松散结构所造成的。
紫外线区域成像系统中，全封闭的微毛细管中不存在样品和空气的接触问题，可防止样品在分析过程中受到损坏或污染，从而可以实现样品的再利用。结合高通量分析的能力，紫外线区域成像特更加适用于生物治疗的早期筛查。
分析类型的灵活性
紫外区域成像的吸引力之一是其具备多种测量的能力。除了单纯的粘度分析，该方法也可以用于对分子大小和样品浓度进行分析。
由于被较大的分子遮盖，对位于复杂体系中的小分子大小进行表征描述的难度非常高。因此，传统的尺寸测量方法要求使用高浓度的样品，以确保分析的有效性。用紫外区域成像进行尺寸分析可不受分子大小的限制，为上述问题提供了潜在的解决方案。由于不同的样本具有各自不同的UV吸收波长（假设分子的紫外吸收度可以检测得到），就可以特定的检测出目标分子的信号反应。
尺寸的计算与粘度测量的方式类似。随着样品沿毛细管流动，粒子或分子的扩散引起峰值的扩展，但这种扩展会因横向扩散而削弱。存在的分子越小，横向扩散就越迅速，峰值区就越窄。当存在较大的分子时，会使横向扩散减慢，从而使峰值区变宽。
如图3 所示，可利用两个窗口之间峰值区宽度的变化，计算出我们感兴趣的分子流体动力学半径。最后，紫外区域成像还可用作特定活性成分浓度的检测方法。Beer-Lambert 定律将UV 吸收与发色团浓度直接联系起来，从而有可能确定存在于溶液中的某种特定物质的数量及尺寸。综上所述，UV 区域检测仪的应用实现了三种测量功能，即整体溶液的粘度、所含分子尺寸及其浓度的测量。
应用示例 - 赋形剂对蛋白配方粘度的影响
高浓度、低粘度配方开发是目前的重点研究领域，而实现这一目标的一个重要策略是在配方中加入能降低粘度的赋形剂。
添加小分子赋形剂，如精氨酸、二甲亚砜和疏水盐，可以抑制聚合网络的形成，减少高浓度蛋白质溶液的粘度。
近期的一项研究阐述了基于紫外线区域成像的微毛细管粘度计如何识别不同蛋白质赋形剂配方之间的粘度差别，并展示了在一定的粘度范围内 [1] 对适当的候选配方进行筛选时，如何将运用这一技术。下面列出的数据由商业化的紫外区域成像系统（马尔文仪器公司，Viscosizer 200）得到。
在两种不同赋形剂缓冲溶液中含有浓度为400 mg/mL 的牛血清白蛋白 (BSA) 蛋白质原液：两者均含30mM 组氨酸，pH 值为5.3，但其中一种缓冲溶液中还含有200mM 精氨酸。再用这些原液制备一系列稀释液，并用标准紫外光谱法对每种溶液的浓度进行测定。在20℃下，按100 μL/份分装到玻璃小瓶中，并放置到仪器的自动进样器旋转盘上。
在214nm 的波长下，在两个检测窗口间对上述样品的变化情况进行监测。然后将得到的粘度结果记录下来，对彼此作图，并对预先确定的粘度范围进行作图，如图4 所示。
图4 列出了绝对粘度随BSA 浓度变化的曲线。正如预期，配方的绝对粘度随着浓度的增加而增加。当浓度低于250 mg/mL 时，两种缓冲溶液之间没有明显的差异。但当浓度高于250 mg/mL 时，未添加精氨酸的30mM 组氨酸缓冲液中的BSA 配方溶液粘度高于那些含精氨酸的配方。有证据证明精氨酸能够降低蛋白质粘度，特别是在单克隆抗体的研究 [2, 3, 4] 中。
结论
生产高浓度、低粘度的生物治疗制剂是当今医药行业所面临的主要挑战之一。本文所介绍的这种新技术将紫外区域成像与微毛细管粘度计相结合，提供了有效的高通量技术，可在配方浓度下对极少量的未改性样品进行非破坏性分析，从而为生物制药开发提供有力支持。这就使制药厂商得以在药物开发早期阶段筛选候选药物时就能确定其粘度曲线，及早发现后期生产中可能遇到的任何问题提。能够及早判断是否有必要继续（或是终止）对于候选分子进行下一步筛选，将获得很高的经济效益。
参考文献
[1] 《赋形剂对蛋白配方粘度的影响——通过Viscosizer 200 对微量样品粘度计的研究：马尔文仪
器公司应用报告》（2013 年8 月19 日）点击下载
[2] T.J. Kamerzell，A.L. Pace，M. Li，D.M. Danilenko，M. McDowell，Y.R. Gokarn，Y.J. Wang 著：《极性溶剂通过疏水溶质和相互作用降低高浓度IgG1 配方溶液的粘度：配方及生物相容性影响》2013 年，J Pharm Sci，102（4）1182-93
[3] Z. Guo，A. Chen，R.A. Nassar，B. Helk，C. Mueller，Y. Tang，K. Gupta，A.M. Klibanov 著：《疏水盐作为单克隆抗体浓溶液降粘度赋形剂的结构-活性关系》，Pharm Res，2012 年，29（11）：3102-9
[4] J. Liu，M.D.H. Nguyen，J.D. Andya，S.J. Shire 著：《可逆自缔合提高水溶液中高浓度单克隆抗体粘度》，J Pharm Sci，2005 年，94（5）：1928-40
图1：使用紫外区域成像进行样品分析的原理图。检测样品通过毛细管两次流经紫外窗口时的时间区间，而不是检测样品从进样到检测器的时间。
图2：使用旋转流变仪（马尔文仪器公司，Kinexus）以及带紫外区域成像的微毛细管粘度计（马尔文仪器公司，Viscosizer 200）检测自然生成的卵清蛋白剪切变稀现象。
图3：两个窗口之间样品峰形状的变化，用于分析待测样品中分子的流体动力学半径。较小的分子产生的峰形较高而较窄，而较大分子产生的峰形较短而较宽。
图4：含BSA 配方的赋形剂绝对粘度随浓度变化的曲线。图中显示有四种配方的粘度超过临界20cP。
（作者：Lisa Newey-Keane 博士，马尔文仪器公司生物制药产品经理）
