多角度光散射（MALS）检测器工作原理及性能特点

摘要：光散射检测仪能够直接测量分子量分布，因此在凝胶渗透色谱以及尺寸排除色谱法分析中起着重要作用。比较常用的是多角度光散射(MALS)检测仪，因为在某些情况下，它们能为回转半径（Rg）的测量提供最精确的数据，而在另外一些情况下MALS已经成为公认的行业标准。马尔文仪器公司新型Viscotek SEC-MALS 20检测仪的推出，丰富了这一领域的产品选择，并使该项技术成为业界瞩目的焦点。

 

在本文中，马尔文仪器将向您介绍MALS检测仪的工作原理，总结它们在特定应用中的优势，并重点介绍那些决定其性能的特点。本文可以作为帮助用户判断MALS在何种情况下最为适用的指南，并帮助那些有购置检测新仪器的用户作出明智的选择。

 

Synopsis：Light scattering detectors play an important role in gel permeation chromatography and size exclusion chromatography analysis because of their ability to directly measure molecular weight distribution.

 

Multi angle light scattering (MALS) detectors are often chosen, in some instances because they provide the most accurate data for the measurement of the radius of gyration (Rg), and in others because they have become an accepted industry standard. The launch of the new Viscotek SEC-MALS by Malvern Instruments extends commercial choice in this area and draws the technology into the spotlight.

 

In this article Malvern Instruments explains how MALS detectors work, reviews their benefits for certain applications and highlights specific features that define performance. The resulting article provides a guide as to when MALS is the best choice and helps those investing in a new detector to make an informed choice.

 

关键词：尺寸排阻色谱法, 凝胶渗透色谱法, 静态光散射, 多角度光散射, 分子量测定, 色谱法, 光散射, 分子量

 

Key Words：Size exclusion chromatography, Gel permeation chromatography, Static light scattering, Multi angle light scattering, Molecular weight measurement, Chromatography, light scattering, molecular weight

 

光散射检测器能够直接测量分子量分布，因此在凝胶渗透色谱以及尺寸排除色谱法(GPC/SEC）分析中起着重要作用。有的时候会选择多角度光散射(MALS)检测器，因为在某些情况下，它们能够准确检测均方旋转半径（Rg）的数据，而在另外一些情况下MALS已经成为公认的行业标准。马尔文仪器公司新型Viscotek SEC-MALS 20检测器的推出，丰富了这一领域的产品选择，并使该项技术成为业界瞩目的焦点。

 

在本文中，马尔文仪器纳米颗粒和分子表征产品经理Mark Pothecary将向您介绍MALS检测器的工作原理，总结它们在特定应用中的优势，并重点介绍那些决定其性能的特点。本文可以作为帮助用户判断MALS在何种情况下最为适用的指南，并帮助那些有购置检测新仪器的用户作出明智的选择。

 

 

为了精确测量分子量，GPC/SEC系统中越来越多地引入了光散射检测器，这样就无需借助传统的外部校准方法。此外，当系统与粘度等其它检测器结合使用时，还可以得到聚合物构形构像，支化等特征信息。

 

当分子被激光照射时，散射光的强度与其分子量直接相关，这种关系可以用瑞利方程来进行描述。如果能够已知入射光束角度为0°时的散射光强度，那么瑞利方程的应用就能大大简化。但是在这个角度进行测量并不可行，因为散射光信号很难与入射光信号区分开来。

 

这些年来，业界陆续开发出了多种不同的光散射技术，以各种不同的方式解决无法在0°角进行物理测量的难题。在这些方法中可以选择的检测技术包括：直角光散射（RALS）、小角度光散射（LALS）和多角度光散射（MALS）。根据分子的光散射行为不同，比如它们是各向同性还是各向异性的光散射体，可以对其进行分类，这对检测器的选择具有重要的影响。

 

小分子聚合物（通常指大小在10-15nm以下）各个角度的散射光强度都相同，因此可以在任何角度对这些各向同性散射体的散射光进行检测。但是，对于较大的各向异性散射体，其散射光强度会受到角度不同的影响，这使得无法在0°测量的问题更趋复杂。

 

可以说，LALS是适用于所有类型大分子^[1]的最稳定可靠的检测器。然而，MALS在某些领域的应用很广，这主要是因为人们对它能进行多种测量、以及对回转半径（Rg）进行精确测量的独特能力很有信心。Rg是一种很有用的参数，它能描述聚合物的大小，其中还包含了分子结构方面的信息。有些行业，尤其是与蛋白质或生物制药领域相关的领域甚至对MALS检测法进行了标准化。对于希望对这种技术应用进行优化的研究人员而言，掌握MALS检测器的工作原理，了解不同检测系统的利弊十分重要。

 

 

顾名思义，MALS是对分子从多个角度进行光强度测量，而并非局限在单一角度。这些测量结果可用于建立散射光随入射角度变化的函数模型，从而推断出0°入射光时的散射光强度.

 

这种推断需要采用纪尼厄图（也常称作德拜曲线图）来完成。图1为瑞利比（Rayleigh ratio）图，即散射光强度值对入射光角度的函数曲线图。图中的y截距即为入射光在0°时的光散射强度，而Rg则可根据斜率计算得出。

 

图1：德拜图描绘了瑞利比作为sin² (θ/2)的函数关系。y轴截距等于0°角下的瑞利比。

 

最简单的MALS检测器仅在两个点上对散射光强度进行测量，这样的系统样品流量最小，样品保留时间也最短，并且由于结构简单而成为市面上最便宜的MALS检测器。不过，单凭两个角度的检测是难以建立起可靠的校正曲线的，尤其是当德拜曲线呈非线性的时候，而这种情况又比较常见。由于上述双检测点系统的数据外推质量和拟合度较差，因而在多数情况下这种检测系统的结果可靠性也较低。

 

现代MALS系统倾向于配备数量较多的检测点，最先进的系统多达20个。因此，它们能够拟合更加复杂的散射模式曲线，而不是简单的直线。这对入射角度较小的情况来说特别重要，因为入射角度较小时，非线性特性会对所测量的分子量值产生很大的影响。与双点检测产品相比，上述多点检测的系统能够测得更精确的分子量和Rg数据。在选择检测系统时，检测点的数量通常受到普遍的关注，但大家也应该认识到另外很重要的一点，就是尽管测量角度的增加使数据可靠推断的可能性大大加强，但入射角度较小时，检测器质量才是提高测量精度的最关键因素。

 

 

随着MALS系统内检测点数量的增加，仪器在技术上的要求就更为复杂。在检测系统的设计中，既要考虑能够容纳多个点检测，又要做到不降低信噪比，这一点至关重要。为此，制造商开发出一些替代配置，结合不同的小体积样品池设计及其它一些特点，极大提高了MALS技术的测量精度。

 

任何MALS系统都有一个基本特点，就是配有样品池，检测点对置于其中的样品进行测量。传统MALS系统采用横向样品池设计，这样，样品就会以水平方式流经检测点。入射的激光束通过样品池端部射入，并按照与样品流动相一致的方向穿过样品池。检测点被设计在流动相的同一平面上，并通过透镜将光线聚焦其上。

 

图2：传统MALS检测器采用横向样品池，样品沿入射光束同一平面进入该样品池。

 

横向样品池设计可容纳多个检测点，但不一定具备小角度测量的最佳敏感度。对于这种结构，必须使用大样品池，以容纳更多数量的检测点。大样品池占用的体积会明显增加，并限制了检测点在低角度位置的可用物理空间。此外，由此造成的较浅入射角和折射角往往会使小角度测量的信噪比较差，从而降低测量精度。最后，由于不同流动相会引起折射率的变化，因此需要采用不同的透镜来对入射角和折射角进行校正。

 

以马尔文的Viscotek SEC-MALS 20为例，较新的MALS检测器都已重点采用垂直样品池，以突破横向样品池设计固有的局限性。在这种结构中，流动相和激光彼此垂直，并且和横向系统一样可以容纳多个测量角度，但这种设计可以使小角度测量具有更大的物理空间，从而提高了准确测量的概率。

 

图3：在垂直样品池中，光线总是以90°射出池壁，使干扰最小化并且无需对折射率进行修正。

 

在垂直样品池设计中，散射光垂直于池壁射出，最大限度地减少了流动相和池壁界面处产生的干扰，并且流动相折射率的变化也不会对测量角度造成影响。这意味着单个样品池可以处理任何溶剂或任何一种折射率。

 

 

蛋白质聚集被认为是生物制药行业和其它相关领域的一个重要问题。蛋白质具有随时间推移而聚集的倾向，对多克隆抗体和单克隆抗体等生物药物而言，蛋白质聚集体的存在会造成降低疗效和可能刺激免疫反应的风险。GPC/SEC系统经常用于测量蛋白质分子量，并对出现的任何聚集体进行检测和表征。下面所举的案例对MALS检测器在蛋白质聚集体研究中的应用^[2]进行了详细说明。

 

在这一案例中，将一台Viscotek SEC-MALS 20检测器与一台ViscotekTDAmax（均由英国马尔文仪器公司制造）相连接，组成了包含多检测器阵列的GPC/SEC系统，用来对胃蛋白酶样品进行表征。胃蛋白酶是由胃内主细胞产生的酶。在进行分析之前，将样品溶解于磷酸盐缓冲液组成的流动相中。

 

GPC/SEC对胃蛋白酶样品的分析显示出两个明显的峰值。一种组分的分子量测定为34.5kDa，对应于已知胃蛋白酶的分子量35kDa。另一个组分的分子量要高得多，认定该物质为一种聚集体物质。还出现了无法明确识别的第三个组分，分子量约为6kDa。作为消化酶，很可能样本中的胃蛋白酶已经开始消化自身，第三个组分表明出现了一些降解产物。

 

图4 ：胃蛋白酶色谱图。34.5 kDa的峰值对应胃蛋白酶已知分子量，更早的保留时间对应的峰值则由蛋白质聚集引起。

 

尽管产生了显著的光散射峰值，但样品中聚集体仅占材料总量不到1％。识别和量化药物样品中的这类化合物，对于药物开发和遵守严格的药品监管标准来说至关重要。

 

虽然胃蛋白酶单体太小，无法进行Rg测量，但MALS图表明聚集体材料是一种强烈的各向异性光散射体，因此能够计算出聚集物质的Rg值（参见表1）。

 

表1 ：进行胃蛋白酶分析所需的计算参数。使用MALS可以实现聚集体成分的回旋半径计算。

	聚集体	单体	降解产物
RV(保留体积)峰值(ml)	10.84	18.33	20.92
Mn– (kDa)	3892.0	34.4	4.7
Mw – (kDa)	4431.0	34.7	6.4
Mw / Mn	1.138	1.008	1.364
Rg (w) – (nm)	69.9	N/C	N/C
Wt Fr (峰值)	0.008	0.569	0.423

 

 

MALS是目前广泛应用于整个蛋白质、聚合物和高分子表征领域的一种GPC/SEC光散射技术。MALS在生物制药行业十分盛行，而其对Rg进行计算的能力也在另一些行业受到了高度重视。因此，如何选择一台合适的MALS检测器是摆在许多人面前的一项重要任务。了解MALS检测器器的关键特性，不仅能帮助用户做出决定，还能帮助用户真正获得这一最新创新带来的实际利益和价值。

 

[1]马尔文仪器白皮书《静态光散射技术的GPC / SEC解释》。可访问以下网址下载：www.malvern.com/slsforgpc

[2] 马尔文仪器应用笔记《采用Viscotek SEC-MALS 20对蛋白质聚集进行测量》。可访问以下网址下载：www.malvern.com/secmals20

 

 

关于作者