如何选择立体显微镜

立体显微镜通常被称为实验室或生产部门的主力。选择立体显微镜时，需要考虑哪些因素呢？ 答案是：“看情况”。这是为什么呢? 因为它取决于用途，取决于用户想要完成的任务。立体显微镜基本上是一种工具，用于将三维目标在三个维度中放大。 不同于复式显微镜，立体显微镜能够应付这个任务。

背景知识

格里诺和 Cycloptic®原理

过去的双目显微镜，其特点是透镜系统简单，而且设计和传统的复式显微镜相同。 此类解剖显微镜，正如当时所熟知的那样，主要用于生物学中的解剖用途；当时没有技术上的应用。大约在 1890 年，美国生物学家和动物学家霍雷肖•S•格里诺（Horatio S. Greenough）采用了一项设计原理，今天仍为光学仪器的所有主要制造商所使用。“格里诺原理”基础上的立体显微镜，实现了真正的高质量立体图像。

1957 年，美国光学公司采用了带有共用主物镜的现代立体显微镜设计，并命名为Cycloptic®。它的现代铝外壳下，是两道平行的光束的路径和主物镜，以及一个五步变倍器。此种立体显微镜，制造商除采用格里诺原理外，还采用望远镜或 CMO（普通主物镜）原理，并用于模块化的、高性能的仪器。两年后，另一家美国公司博士伦提出了 StereoZoom® 格里诺设计，作出了开创性的创新： 一步到位的变倍器（变焦）。 今天几乎所有的设计都是基于一个变焦系统。

（左）：Cycloptic®，基于望远镜原理的第一台立体显微镜图 2a、b （右）：立体显微镜的两种基本原理。a：望远镜或 CMO 原理 b：格里诺原理。

立体显微镜的选择标准

时至今日，立体显微镜仍基于提到的技术方法——格里诺或 CMO 原理。

四个事项需要仔细评估：

a）用途是什么？
b）哪种结构需要观察、记录或可视化？
c）有多少人在使用显微镜？
d）解决方案的可用预算是多少？

一旦上述因素已知，则可以归结为以下标准。

放大倍数、变焦范围和物场

景深和数值孔径

光学质量和工作距离

人体工学

照明

放大倍数、变焦范围和物场

立体显微镜的总放大倍数，是变倍器、物镜和目镜的放大倍数的组合。

变倍器或变焦体

像放大镜一样，变倍器由光学透镜构成，可以用来改变仪器的放大倍数。改变变倍器的位置，会改变图像放大的程度。图像放大的程度称为放大倍数。现代立体显微镜能够提供 16 倍放大（只有变焦体），20.5:1 的变焦范围，其特点是能够进行可靠测量的机动化或编码。

接下来，图像通过目镜得到进一步放大。为找出目镜中观察到的目标的放大程度，用户必须将变倍器和目镜的放大倍数相乘。

然而为了保证完整性，提供公式如下：

MTOT VIS 为我们要计算的放大倍数。 VIS 代表“视觉”。

z 是变倍器的等级。

ME 为目镜的放大倍数。
MO 为主物镜的放大倍数（当格里诺系统中未使用辅助透镜时为 1 倍）

物场

当从适当的距离向目镜中观察、而且瞳孔间距设置正确时，可以看到称为物场的一个圆形区域。 物场的直径根据放大倍数而变化。换言之，放大倍数和物场直径之间存在着数学关系。 10 倍目镜提供的物场数是23。这意味着变焦体和主物镜放大 1 倍时，物场大小为23mm。 3 倍放大时物场减少到三分之一，即物场的直径仅有7.66mm。

景深和数值孔径

在显微镜中，景深往往被视为一种经验参数。 实际上它是由数值孔径、分辨率和放大倍数之间的相关性确定的。为了得到最佳视觉印象，现代显微镜的调整设施会在景深和分辨率——在理论上具有负相关性的两个参数——之间产生一种最佳平衡。

视觉景深的实际价值

在视感景深这个问题上，Max Berek 是第一位发表观点的作者，早在 1927 年他就发表了经过大量实验得来的结果。Berek 公式给出了视觉景深的实际值，因此今天仍然使用。

其简化形式如下：

TVIS：视感景深

n：目标位于其上的介质的折射率。 如果目标被移开，则在公式中输入介质的折射率，该介质形成变化的工作距离。

λ：使用的光的波长，对白光来说，λ = 0.55μm

NA：目标一侧的数值孔径

MTOT VIS：显微镜的视觉总放大倍数

如果以上方程中，视觉总放大倍数为有效放大倍数所取代（MTOTVIS = 500 - 1000 x NA），则可以看出，景深的第一个近似值与数值孔径的平方成反比。

特别是放大倍数较低时，景深可以通过缩小镜头光圈（即减少数值孔径）显著增加。 这通常是通过光圈或一共轭平面上的光圈完成的。然而，数值孔径越小时，横向分辨率就越低。

因此问题是找到分辨率与景深（取决于目标结构）之间的最佳平衡。在立体显微镜中，为了更高的景深，常常需要做出一定的妥协，因为三维结构的 z 值经常有此要求。

带景深的格里诺立体显微镜的目标平面

更多景深——FusionOpticsTM

FusionOptics™是一种复杂的光学方法，能够消除立体显微镜中分辨率和景深之间的关系。在这里，光路之一为观察者的一只眼睛提供了高分辨率和低景深的一副图像。通过第二光路，另一只眼睛看到相同目标的低分辨率和高景深的图像。人类大脑会将两个独立的图像组合成一个最佳整体图像，其特点是分辨率高和景深高。

另一个说明人类大脑非凡能力的例子是格里诺立体显微镜。在这里，左右光路的目标平面彼此形成一个微小的角度。在整体图像中，产生的整个区域似乎显得清晰,尽管左边或右边的图像并非如此。

现代立体显微镜，其特点是 20.5:1 变焦范围、APO 校正光学系统和 FusionOptics™。

光学质量

立体显微镜的光学质量通常列为 Achro 或 Achromat（消色差），以及 Apo（复消色差），代表球形和色差的最高程度的校正。场曲率校正缩写为 Plan，而 PlanApo 是色差和场曲率校正的组合。

Achro, Achromat：消色差校正

Plan：平场光学校正

PlanApo：复消色差和平场校正

色差是什么?

在立体显微镜等光学仪器中，色差是一种失真，镜头无法将所有颜色集中到同一个会聚点。这是因为镜头对不同波长的光有不同的折射率(透镜的色散)。折射率随着波长的增加而减少。良好的光学设计的目的，是减少或完全消除此种影响。

消色差透镜是一种旨在限制色差和球面像差的影响的透镜。消色差透镜经过校正后，将两种波长（通常为红色和蓝色）聚焦到同一个平面上。此类透镜或显微镜用于以下任务，即无需颜色复现和主要是评估几何特性。另一方面，复消色差透镜旨在较正三种波长（红、绿和蓝色），将它们聚焦到同一个平面上。工作距离

这是标本聚焦时，物镜前镜头和和标本顶部之间的距离。在大多数情况下，物镜的工作距离随着放大倍数增加而减少。在立体显微镜中，工作距离是最重要的标准之一，因为它直接影响着显微镜作为工具的可用性。

人体工学镜筒——身体和头部放松，手臂有舒适支撑，腿部有足够空间，并充分利用椅子。

人体工学——千人千样

人有高有矮，这使得仪器需求成为个人问题。例如，为一定的任务配备的显微镜，有配件和特定的工作距离，其现有高度可能相当不适合特定的用户。如果观察高度过低，观察者在工作时将被迫向前弯曲，导致颈部肌肉紧张。因此在理想状态下，显微镜的观察高度和视角，应根据用户的体形调整。此外，可变的观察高度，是用来防止完全久坐不动的姿势的最佳方法。它允许观察者采用个人坐姿，并按照自然的冲动周期性地改变，以便不时左右移位。的确，椅子的高度可以改变，这样一种放松、微微弯曲的姿势代替了之前的正襟危坐，但这不是最佳方法。更简单、更舒适的方法是使用一种可变的双目镜筒，以弥补身高的差异。

由于采用了模块化产品的方法，带有 CMO 设计的立体显微镜可以根据用户的尺码或工作习惯提供的多种方式定制仪器，因而是首选方案。

照 明

在立体显微镜中，照明是将所有的工作暴露在光线下的关键。正确的照明将仅仅通过改变光的类型，便使所需的结构可视化，或有关样品的新信息被发现。重要的是，将照明正确地匹配到正确的显微镜和正确的用途上。

现代立体显微镜照明系统基于持久的发光二极管，并提供独特的方式，将解决方案整合到整个显微镜系统。高度整合的环形光源和使用中的偏振器，是为了减少标本上的眩光。

照明类型

入射

入射光主要用于不透明的标本。此种光（环形光、射灯等）的实现方法将取决于标本纹理和使用需求。入射光为各种各样不透明的标本所需要。根据标本纹理和结果目标，入射照明方案的一种折衷选择是可用的。

透射光

透射光对于各种透明标本很理想，范围从生物样品（如生物模型）到聚合物。

标准透射明视野照明

标准透射明视野照明用于所有类型的透明标本，其具有高对比度和足够的颜色信

斜透射照明

此种照明技术用于几乎透明、无色的标本。由于照明的斜位置，可以实现标本更大的对比度和视觉清晰度。

暗视场照明

立体显微镜中的暗视场观察，需要一个包括反射镜和遮光板的特制的台子，以便将一个倒置的照明空心锥体以倾斜角度向标本方向移动。暗视场照明的原理要素，对于立体显微镜和更传统的复式显微镜是相同的，通常配有复杂的多镜头聚光镜系统、或带有特制内镜的聚光镜，该内镜包含调整为特定几何形状的反射面。

清晰、透明标本的对比方法

Rottermann Contrast™ 是一种局部照明技术,其显示亮度不同时折射率的改变。相位结构通常在正地形对比中表现为立体的、浮雕式的图像（如山丘），而在倒转地形对比中表现为凹进。此种技术提供了许多变量视图，以此提取最大可能的信息量。

结 论