在胃癌（GC）发生过程中，DAN甲基化转移酶3A的功能作用机制目前还不是很清楚。在该研究中，研究人员发现外源表达的DNMT3A通过打乱G1/S的转换而促进肝癌的细胞增殖。同时该研究找到了DNMT3A的下游靶基因p18INK4C，异位表达DNMT3A在转录层次抑制了p18INK4C的表达水平。在GC细胞中减弱p18INK4C的表达诱导细胞周期过程，在DNMT3A过表达细胞中重表达p18INK4C可减弱G1/S的转换。深入研究发现，DNMT3A通过直接调控p18INK4C启动子区的甲基化程度来影响其表达。临床GC样本检测发现，癌组织中p18INK4C的甲基化水平明显高于配对癌旁组织，DNMT3A的表达水平与p18INK4C的表达呈负相关。这些发现提出了胃致癌过程的新的见解，也为胃癌治疗提供了潜在的靶标。该研究中DNMT3A下游靶基因筛选表达谱芯片Affymetrix HTA2.0由上海伯豪生物技术有限公司提供。
研究背景：
在肿瘤发生的早期过程中，表观遗传调控机制——DNA甲基化起着非常重要的作用。真核细胞表达3个DNA甲基化转移酶：DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中，已有研究发现DNMT1和DNMT3B在肿瘤的起始和发展阶段发挥着重要作用，但是，对于DNMT3A在肿瘤中的功能作用机制还不是很清楚。
胃癌在世界范围内，尤其是在中国，是一种最常见的高发病率和死亡率的恶性肿瘤之一。有研究发现DNMT3A在多种肿瘤（包括胃癌）中表达异常。在胃癌中，尤其是DNMT3A的表达明显比DNMT1和DNMT3B高。最近的研究也发现在胃癌病人中，只有DNMT3A的高表达伴随着差的总体生存率。这些发现预示着，在胃癌中，DNMT3A可能扮演着非常重要的角色。因此，深入研究胃癌发生过程中DNMT3A的功能作用机制显得尤为重要。
研究思路：
研究结果：
1. DNMT3A对GC细胞的增殖非常重要
首先，研究人员对胃癌细胞系AGS和BGC-823进行了DNMT3A基因的敲降（AGS-shDNTM3A和 BGC-shDNTM3A），发现细胞生长速率显著降低，foci formation形成频率也降低。当检测外源过量表达DNMT3A细胞系MKN45时发现，生长速率显著增加。在裸鼠中移植AGS-shDNTM3A和 BGC-shDNTM3A细胞系后发现肿瘤体积明显比对照小。这些结果表明DNMT3A对胃癌细胞的增殖是必需的。
2. DNMA3A通过打乱G1/S的转换促进细胞生长
肿瘤细胞的生长紊乱通常与细胞周期过程的加快相关。同样处于G1期（72%）的AGS-shDNTM3A和对照释放12h后，敲降组中处于G1期的细胞比率明显高于对照。在过表达细胞系MKN45和BGC-823中得到了相反的结果。为了探究该现象的内在分子机制，研究人员对敲降和过表达细胞系中的7个G1/S转换调节基因的表达进行了检测，发现cyclinD1, CDK4 和CDK6在过表达细胞系中表达增加，敲降细胞系表达降低。这些结果表明DNMT3A通过破坏G1/S的转换刺激细胞周期过程的发生。
3. DNMT3A下游靶基因鉴定
为了深入研究DNMT3A调控胃癌细胞周期过程的作用机制，研究人员进行了下游调控基因筛选。通过对过表达细胞系和对照细胞系表达谱芯片（HTA2.0）检测后发现，有558个下调和348个上调基因。GO分析发现主要的分子功能涉及结合与催化活性功能，生物学过程涉及细胞增殖，细胞粘附，细胞周期过程等，暗示着DNMT3A可能通过这些过程影响致癌。
（a） 表达谱芯片筛选差异基因GO分子功能分析结果；
（b） 表达谱芯片筛选差异基因GO生物学过程分析结果。
在其中有5个下调基因与细胞周期过程相关：BLM, CDKN1B, CCNE2,p18INK4C和CKS1B，他们与CDK的活性调控关系密切。qRT-PCR结果验证表明DNMT3A抑制了p18INK4C表达，当在过表达细胞系MKN45-DNMT3A中加入DNA甲基化转移酶抑制剂（5-Aza）后，p18INK4C的表达异常得到恢复。这些结果表明p18INK4C是DNMT3A的主要下游靶基因。
4. p18INK4C涉及DNMT3A调控的G1/S转换
流式细胞分选实验表明，在细胞中敲降p18INK4C可以增加G1/S转换的细胞数量。Western blot分析显示，CDK4和CDK6的蛋白表达增加。当在DNMT3A过表达细胞系中重表达p18INK4C后发现细胞生长速率减慢，G1期的细胞比率恢复。异位表达p18INK4C可以抑制CDK4和CDK6的蛋白表达。这些结果表明p18INK4C参与DNMT3A诱导的G1/S转换。
5. DNMT3A通过DNA甲基化抑制p18INK4C的表达
DNMT3A敲降细胞系BGS检测p18INK4C启动子区CpG island区域，发现甲基化程度明显低于对照。ChIP实验表明DNMT3A可结合到p18INK4C启动子的CpG island区域。这些结果表明DNMT3A可以直接结合到p18INK4C启动子区的CpG island区域影响其甲基化程度。
6. 临床GC样本中p18INK4C甲基化程度异常
25对临床GC样本和癌旁样本检测p18INK4C启动子区的25个CpG位点，发现癌组织中甲基化水平明显高于癌旁，p18INK4C的mRNA水平也显著降低。
7. 临床GC样本中DNMT3A与p18INK4C表达相关
35对临床GC样本和癌旁样本检测DNMT3A表达，发现有22个（63%）中蛋白表达升高，并且与临床病理指标一致。qRT-PCR检测p18INK4CmRNA表达水平发现其与DNMT3A蛋白表达水平负相关。
该研究中DNMT3A下游靶基因筛选表达谱芯片Affymetrix HTA2.0由上海伯豪生物技术有限公司提供。
原文出处: Cui H, Zhao C, Gong P, Wang L, Wu H, Zhang K, Zhou R, Wang L, Zhang T, Zhong S, Fan H. DNA methyltransferase 3A promotes cell proliferation by silencing CDK inhibitor p18INK4C in gastric carcinogenesis. Sci Rep. 2015; 5: 13781.
