微生物的实验可以分为两大部分: 准备培养基和样品检验。
事实上, 保持整个实验室清洁是非常重要的, 这样就不用在灭菌前担心太多了, 然而, 灭菌后必须保证样品或者培养基免受污染。其实, 可以把灭菌想像成”一扇门”, 在培养基中或者一些设备比如吸管的微生物都在灭菌过程中被杀死了, 没有微生物困扰实验了。必须保证灭菌后的环境(门后的部分)的洁净, 杜绝灭菌后的培养基和设备受到污染。
无菌的重要性
无菌技术 – 高压湿热灭菌
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要点 |
描述 |
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原理 |
在压力下产生的湿热的蒸汽杀死微生物的营养体和孢子. |
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密封 |
灭菌锅必须密闭以阻隔外部空气, 避免空气的存在会影响压力并降低灭菌锅里面的温度 |
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灭菌压力 |
在灭菌国内, 合适的灭菌温度是通过压力达到的, 压力对于灭菌没有效用但是使蒸汽温度上升. 对于标准操作来说, 15lbs/inch2时的1210C并赶走所有空气可以达到灭菌的效果 |
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灭菌时间 |
当到达一定的温度和压力时, 需要保持一定的时间来达到效果, 为了杀灭微生物, 1210C必须保持至少15分钟。 |
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培养基的灭菌 |
大部分情况下, 实验室配置培养基后应灭菌, 灭菌时应根据供应商指导, 使用合适的温度时间; 有些培养基不适合灭菌的. |
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器皿的灭菌 |
当灭菌那些器皿时, 需要考虑使用数量, 比如, 一天用10根吸管, 在灭菌时, 一般就可以以10根为一包, 这样可以减低器皿在使用过程中遭受微生物的污染的可能性. |
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灭菌条 |
在灭菌过程中, 可以用灭菌条来监控效果, 灭菌条在灭菌前是有颜色的, 灭菌后会变成黑色. |
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重新灭菌 |
假如一次灭菌无效, 可以重新进行灭菌过程, 但是, 培养基是不可以进行第二次灭菌的, 应抛弃. |
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储存 |
灭菌完成后, 培养基和器皿应妥善储存. 一般来说, 培养基应存放于避光的洁净空间, 同时应参照供应商的指示. |
无菌技术 – 过滤 (Filtration)
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要点 |
描述 |
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简述 |
物理分离方法, 使用高效过滤将微生物从液体培养基分离 使用于对热敏感的培养基和化学品, 比如, 当需要酒石酸来调节OSA的酸度时 由于不需要加热和冷却过程, 过滤比高温湿热灭菌省时间, |
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过滤头 |
0.2微米的过滤头可以分离所有的细菌营养体, 把它安装在针筒末端. |
无菌过程注意点
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要点 |
描述 |
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综述 |
一旦培养基或者器皿经过灭菌过程, 这种灭菌状态应保持直到实验结束. |
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区域 |
最好能把培养基准备区域(门外)和实验区域(门内)分开. |
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工作台面 |
工作前必须消毒, 可以用70%的酒精, 也可以用含氯的消毒剂. |
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消毒时间 |
不管使用何种消毒剂, 需要提供充分的消毒时间来杀灭微生物, 一般5-10分钟. 可以用纸巾擦干表面 |
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洁净台 |
必须有2个光源: 普通照明用和杀菌紫外光. 紫外灯用于保持工作台面免于微生物污染. 在使用前仍然需要使用消毒剂清洁. |
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摆放 |
应该有好习惯把工作桌面的物品摆放好, 把移动放到最低限度, 避免带来污染 |
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镊子 |
如果使用薄膜过滤法, 需要准备一个小烧杯并有少量酒精, 镊子不用时就放在杯子里 |
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培养基 |
培养基使用前, 应该有相关日期, 比如配置日期, 或者实验室收到日期(直接使用的培养基). 假如没有所需日期, 这个培养基不能使用. |
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实验服 |
穿着干净的实验服, 袖子应卷起至肘部以避免碰到培养基或样品带来污染, 当然, 做实验前要洗手. |
实验的无菌技术注意点
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采样 |
个人卫生 |
酒精灯 |
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样品应无菌采得 使用无菌采样袋或者采样瓶 采样员应戴防护手套, 在采样前烧采样口 样品容器应紧闭并安全储存. |
万一培养基或者样品溅到实验服上, 应在做完一个实验后换上干净的 咳嗽或者鼻塞可能会带来微生物并影响实验, 应戴好防护手套面罩.
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使用本森灯或者酒精灯, 在实验前点燃 火焰在实验区域产生一个防护层, 可以防止那些悬浮在空气中的微生物掉落在工作台面上或者培养基上. |
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开瓶 |
瓶口 |
培养皿 |
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开瓶前, 应用清洁剂的纸巾清洁瓶盖和附近区域, 除去盖子上可能留存的微生物 |
盖子打开后, 玻璃瓶口应进行灭菌, 可以在酒精灯上方旋转瓶口和螺纹, 一般2-3秒. |
当打开培养皿时, 不能完全移除盖子, 而应该保持在培养皿的上侧, 从而能够倒入培养基或者样品, 这样可以减少空气灰尘或者微生物的污染; 倒完培养基或者样品后, 瓶口重新过火, 盖盖子, 用消毒剂清洁. |
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滤膜 |
镊子 |
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打开薄膜包装, 绝对不能碰到薄膜! 用镊子把薄膜移除包装并放到过滤头上, 过滤的漏斗不能完全移开, 只需移开一点点放入滤膜即可 过滤完后, 用镊子把滤膜转到培养皿中, 放置于中间 |
用镊子转移滤膜 过火时, 拿住镊子的尾部, 放到火焰上, 保持一下能够到火就好, 时间太长会在尖部结碳 拿镊子的时候, 尾部向上直至烧完. |
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实验结束 |
打扫 |
废弃物 |
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实验结束后, 培养皿放入培养箱; 剩余的培养基可以放回储存区域, 盖子必须盖紧 |
抛弃废弃物, 比如样品袋; 可回用的物品放在远离工作区域的地方以回收, 清洗, 灭菌. 用含有消毒剂的纸巾清洁工作台面. |
在实验过程中暴露于微生物的物品应作为有害废弃物 这些废弃物可能含有微生物并致病; 假如含有致病菌可能会产生公共卫生的事件. 最好废弃物能够进行湿热灭菌 |
一个设计合理的实验室能提供一个合格的环境以支持实验能够安全有效地进行. 首先, 需要为实验室选择一个合适的物理位置:
远离其他操作区域, 比如, 生产或者储运；
没有从其他区域进入实验室的直接入口；
实验室必须是微生物实验专用；
实验室应分为准备区域和测试区域. 湿热灭菌锅, 作为这两个区域的典型的分隔(门). 这种分隔保证了能有效使用无菌技术并帮助防止培养基和样品的交叉污染；
假如两个区域无法分开, 实验室应根据实验准备和测试两个行为来区分不同的区域。
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通风和气流 |
安保 |
工作区域 |
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微生物实验室应该有单独的通风系统, 与其他操作区域的空气供给分开; 房间应该是负压的, 这表示实验室里面的空气永远是向内流动的; 空调系统的排气必须直接排出实验室, 空调系统应定时清洗, 并关注空气过滤器的清洁 |
实验室应该是限制进入的, 可以是卡片控制或者其他方式, 只有那些被允许进入实验室的人员才能进入 |
实验室人员应该有充足的工作区域, 从GLP标准来说, 每人应有20平方米的区域. 充足的工作区域可以避免工作中人员的碰撞, 也避免了交叉污染. |
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易清洁 |
门和窗 |
照明 |
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实验室的墙面, 屋顶和门都应该是平滑的, 光洁易于清洗消毒的; 墙的接缝包括强和墙之间, 强和地面之间应该是弧形的 任何地方都应该不能聚集灰尘, 例如窗台或者窗帘 柜子应该是可移动的或者是不着地的以方便清扫. |
窗户应密封, 门应紧闭以避免外面空气进入实验室 如果窗户坏了或者有裂缝额, 应及时报修, 并尽快修好 |
实验室应有充足的照明, 包括不间断电源或者备用发电机. |
遵照GLP相关的安全规则
1.GLP要点 – 工作区域
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要点 |
描述 |
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总体安排 |
实验前应做好仪器, 试剂和培养基的所有准备工作, 这样可以合理利用时间并得到稳定的实验结果 |
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桌面安放 |
多余的培养皿, 烧瓶或者滤纸可能会干扰实验并带来潜在的溅出, 打碎或者交叉污染. |
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实验前消毒 |
在配制培养基或者开始试验前, 应该清洁并消毒工作桌面. 最佳的消毒剂是70%的酒精溶液, 含氯水的溶液, 或者公司批准的其他消毒剂. 最好使用一次性的消毒纸巾, 不能使用毛巾或者海绵. 清洁后, 应等待几分钟以使有充分的时间杀灭微生物, 可以用纸巾擦干. |
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试验后消毒 |
实验结束后, 彻底清洁工作区域, 仍然使用70%酒精溶液或者公司批准的其他消毒剂, 保持一段时间, 然后擦干 |
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有害废弃物的处置 |
必须有效管理微生物的有毒废弃物, 任何和微生物培养或者培养基相关的物品都应被看作有害物质; 因为他们可能含有致病菌, 需要小心处理 |
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废弃物的灭菌 |
湿热灭菌是最简单也是最有效的处理污染物质和有害物质的方法. 用过的培养皿应放在灭菌袋中. 灭菌后, 可以当作一般废弃物处理 |
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重复使用器皿的灭菌 |
当需要对小件物品(比如移液管)灭菌时, 可以根据实际用量分组包装. 湿热灭菌后, 袋包装冷却并保存. |
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避免浪费 |
合理安排是非常重要的; 实验室工作需要精准, 但是有时候我们也需要快速工作, 因为花非常多时间会延长设备, 培养基, 或者样品暴露在环境中的时间. 把需要用的物品放在手边可以用的地方可以节约时间并提高工作的有效性. |
2.GLP要点 – 洁净工作台
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简介 |
使用 |
监控 |
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洁净工作台提供了控制来自环境的污染并提供工作区域的洁净空气. 洁净空气吹向工作区域, 同时, 可以避免外部空气进入工作区域 |
使用时, 紫外光线(或者紫外灯)应关闭, 但是使用后应打开. 如果紫外灯没有打开工作台没有开启, 工作台不能开始使用; 必须清洁工作台, 开启电源并打开紫外灯, 保持30分钟. |
洁净工作台需要进行日常的确认, 一般有第三方公司进行. |
应该是一个安全的实验室. 假如疏忽安全的话, 许多每天使用的培养基或者设备会产生危害. 减少这些危害带来的风险不仅仅保护了工作场所, 更重要的是, 保护了自身免于危险。
利用常识并遵照GLP相关的安全规则, 我们就能把由于微生物相关的行为带来的潜在危害降低到最小。
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安全用品 |
移动 |
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安全用品包含口罩, 手套和眼部防护. 口罩防止培养基和样品受到污染, 可能来自于咳嗽或者鼻涕; 根据当地的要求和习惯, 每个实验室会有不同的要求 戴手套是为了防止培养基或者其他刺激性物质接触皮肤; 在从湿热灭菌锅内取出容器或则器皿时, 需要戴防热手套 在配置培养基和实验中佩戴防护眼镜是一个很好的习惯, 能够购买带有屈光度的防护眼镜为佳. |
当移动培养基或者样品时, 应小心注意以避免溅出或者泼出; 突然的移动会产生安全危害或者导致实验无效 不要使用夸张的动作或者行为 同时, 不要把任何东西, 比如吸管, 放到嘴里 |
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明火 |
湿热灭菌锅 |
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实验中需要用到酒精灯或其他明火, 但是假如使用不当会带来比较高的安全危险 确保酒精灯不用时完全关闭, 当有阀门时经常检查垫圈是否有裂痕或者泄露. 操作酒精灯时, 应确保火焰不会接触衣物或者皮肤. 可燃物品, 比如记录本, 应远离火焰以避免意外点燃. 同时, 要注意可燃液体的容器. 每次使用后应盖好盖子并远离酒精灯火焰 使用火焰进行灭菌工作时, 可使用镊子. 把镊子放在含有95%酒精的烧杯中, 使用时, 把镊子在火焰上灼烧1-2秒, 移开镊子并等待火焰熄灭. 拿着镊子是尖端应向下, 使热的酒精不会流到手上. |
湿热灭菌锅使用高压下产生的蒸汽, 温度可达1210C, 杀死了微生物, 同样可以带来人类组织的灼伤, 所以必须特别小心地操作; 如此高的温度以及蒸汽能带来极大的潜在伤害, 即使是残留的蒸汽也能带来很大的危险. 打开灭菌锅时需要特别小心, 站在边上避免面对热量和蒸汽, 缓慢的打开门, 同时, 戴好防热手套. 把需要灭菌的培养基和器皿平均放置在托盘上, 大的物品放在边上, 确保物品不会相互碰撞. 这样可以是热量均匀扩散并平衡整个托盘 |
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洁净台 |
样品操作 |
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在洁净台工作时必须关闭紫外灯. 紫外光线是危险的, 不要把手或者手指放在紫外灯下, 以免灼伤皮肤; 不要直接看紫外光线以免损伤眼睛 |
培养基和样品: 用火焰灼烧瓶口时, 停留4-5秒, 旋转使整个表面都能被灼烧, 不要停留太久, 不要溅出样品或者培养基 假如样品是瓶装的, 不要直接灼烧以免爆开. 可以取2个烧杯, 倒入70%酒精, 把瓶子倒置放入一个烧杯中, 使盖子和瓶颈的2.5厘米处能浸没在酒精中, 拿出瓶子用干净的布擦干; 同理, 放入第二个烧杯, 拿出瓶子直立待酒精自然蒸发. 开瓶时应特别小心不能污染样品, 可以用消毒纸巾开旋盖的瓶子; 用浸没在95%酒精并灼烧的开瓶器打开压盖瓶. 打开瓶子后, 使用相同的方法灼烧瓶口, 并确保用于消毒的酒精完全挥发. 拉罐可以使用相同的程序或者用含70%酒精的棉球擦拭顶部, 假如罐子必须用开罐器, 这个开罐器操作同开瓶器. 无菌包装的产品用含70%酒精的棉球擦拭. |
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1.一级防护（设备）
1.1移液辅助器，如移液器
1.2生物安全柜
1.3一次性塑料接种环、电热接种环
1.4螺口盖试管及瓶子
1.5高压灭菌器
1.6一次性塑料移液管
2.二级防护（人员）
2.1工作服、防护服
2.2手套（乳胶手套等）
2.3安全眼镜、面罩或其他防护用品
——————常见问题Q&A——————
细菌和霉菌培养箱必须分开放置吗？
在CNAS-CL09:2013《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明 》有此规定：5.3.3 e)检测样品中的霉菌时，要有适当的措施控制孢子在空气中的扩散。但未见到明确规定细菌培养箱和霉菌培养箱不能在同一房间的规定。一般实验室都有三种培养箱，结构设计上分为两种，一种是内部循环风温度平衡的，第二种是内外热空气流动自动平衡型的，另外第三种是热辐射温度平衡型的。有网友认为，第一种和第三种应该可以放在一个实验室，保持一定距离即可。第二种培养箱应该不能放在一个实验室。据说，CNAS现场评审，会提出细菌和霉菌培养箱分开放置要求。
防止培养基长霉的方法
当环境温度不适应果蝇生长时(温度低于18℃) ,培养基接种后的7d内,特别容易长霉。
要避免长霉,应注意:
①培养果蝇的器皿要严格消毒。培养瓶洗干净后,自然凉干, 再与棉塞一道进行高温干燥灭菌(120℃, 30min) 。
②培养基营养要全面。果蝇培养基的种类很多,本实验室用的是玉米培养基,配方如下:水750mL煮开,加琼脂6. 2g,待琼脂溶解后加白糖62.5g,搅拌溶解后加调成糊状的玉米糊(玉米粉82. 5g,用冷水调成糊状) ,煮开2～3min,加酵母粉7g,加热1～2min,搅拌均匀后,移去火源,加丙酸2mL (起杀菌防霉的作用) 。培养基稍稍冷却后,倒入已灭菌的培养基瓶中,尽量不要让培养基粘在瓶壁上,塞好棉塞,放入仍有余热的干燥箱中将瓶壁上的水蒸干。
③接种时消好毒。在无菌室内接种, 如没有无菌室, 在接种前用75%酒精棉球擦双手一遍。接种后,放入适宜果蝇生长温度的培养箱中培养果蝇(温度20～25℃) ,一旦下一代成蝇孵出来后,培养基就不易长霉。
一般微生物实验室只有一个培养室，而用于微生物培养的培养箱一般是内循环的。所以是可以同一个房间的。
