今年1月10日，施一公教授团队在另一顶级学术期刊《科学》（Science）发表了该领域的又一重要研究成果，拉开了2019年我国生命科学领域研究的序幕。
近年来，施一公教授及其所带领的团队一直将揭示阿尔兹海默症的发病机理作为重点研究方向，经过长期不懈的努力，取得一系列重要突破。研读间第一时间联系了两篇论文的共同第一作者，生命学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者杨光辉，为我们讲述了研究过程背后鲜为人知的故事。
「双杀」：连发两篇顶级期刊
2018年12月31日和2019年1月10日，清华大学施一公教授研究团队分别于顶级学术期刊《自然》（Nature）和《科学》（Science）发表两篇与阿尔兹海默症关键蛋白作用机制相关的研究成果，《人源γ-分泌酶识别底物Notch的结构机制》（Structural Basis of Notch Recognition by Human γ-secretase）和《人源γ-分泌酶底物淀粉样前体蛋白的识别》（Recognition of Amyloid Precursor Protein by Human γ-secretase）的文章，完成了跨年「双杀」。两篇文章报道了人体γ-分泌酶结合底物Notch以及和淀粉样前体蛋白（APP）的高分辨率冷冻电镜结构，从分子层面为理解γ-分泌酶特异性识别和底物切割的机制提供了重要认知基础，为研究与阿尔兹海默症以及癌症相关的发病机制、特异性药物设计提供了重要的结构信息。
突破：提供「狙击式」潜在治疗方案
阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease, AD）是当今世界面临的最为严峻的神经退行性疾病。主要临床表现为脑组织切片中出现淀粉样斑块、神经元死亡、认知和记忆能力受损，最终脑功能严重受损直至死亡。统计结果表明，在65岁以上人群中，其发病率高达10%，在85岁以上人群中，发病率更是达到30-50%；我国目前患该病的人口高达500万，约占世界患者总数的四分之一，并且由于世界范围内预防治疗手段不足、缺乏特效药物，该疾病有发病年龄提前、发病人数增加的趋势，给病人及家属造成极大痛苦，也同时为社会带来沉重负担。
阿尔兹海默症的发病机理尚不明确。病人脑组织中的淀粉样斑块，是由淀粉样蛋白前体蛋白（APP）被酶切割产生的短肽聚集而来。除了淀粉样蛋白，重要的信号蛋白Notch也是γ-分泌酶的底物。Notch的异常切割会导致发育的异常，与一些诸如T细胞急性淋巴细胞白血病在内的癌症发病也有重要联系。
「如果把底物Notch或者APP比喻成一根绳子，那么γ-分泌酶的作用就是要把这根绳子剪成一段一段。如果切割产生异常，或者这些剪出来的小段缠绕在一起就有可能导致疾病。」此外，「作为与阿尔兹海默症和癌症均紧密相关的蛋白，很多药物的研发直接以γ-分泌酶作为靶点，希望通过调节其活性来治疗相关疾病。」
近年来，多种旨在减少淀粉样沉淀的γ-分泌酶活性抑制剂的临床实验均宣告失败，较为著名的是礼来公司临床实验的Semagacestat。这一抑制剂虽然能够减少淀粉样沉淀，但并不能改善患者的认知状况，更严重的是由于同时抑制了γ-分泌酶对Notch的切割，导致患者罹患癌症的风险大幅增加，最终该临床实验提前终止，而对γ-分泌酶结合底物机制研究的缺失是造成这一失败的原因之一。基于此，获得γ-分泌酶与底物Notch以及APP复合物的结构，对研究γ-分泌酶的底物识别酶切机理和以γ-分泌酶为靶标的特异性药物设计具有极大科学意义和潜在应用价值。
研究团队认为，这或许为开发底物特异性的抑制剂带来启发。类似于从「霰弹枪」到「狙击枪」的过度，未来可以开发特异地抑制β淀粉样前体蛋白APP的加工而不影响Notch加工的药物，靶向治疗阿尔兹海默症且不导致副作用。与此同时，这两篇文章通过细节方法的创新，首次揭示了膜内蛋白水解酶与底物复合体这一大类的结构信息。
科研：挑战与惊喜并存
研读间第一时间联系了两篇论文的共同第一作者，生命学院博士后、结构生物学高精尖创新中心卓越学者杨光辉，为我们讲述了研究过程背后鲜为人知的故事。
Q1：在研究过程中有什么曲折的经历？
有的。课题难度很大，最难的点在于获得稳定的酶和底物的复合体，这一状态很难捕捉。我们前期在蛋白质设计上做了很多工作，直到最后采用了文章里描述的交联的办法。
Q2：研究过程中有什么印象特别深刻的事吗？
印象深刻的事很多。施老师实验室一直在做γ分泌酶相关的工作，我自己也一直在思考如何解析γ分泌酶与底物结合的结构。很早就在思考，但是初期各种蛋白质设计的方法并不能获得酶和底物稳定在一起的状态。
在读文献的过程中看到了酶与底物可能发生相互作用的部分位点，有了一些线索。从2017年初想到并开始尝试使用交联的方法，然而也不知道哪几个氨基酸位点能交联在一起，于是就在有限的线索下进行尝试，希望能够筛选出最优解。我们最终成功获得了这个解答，并且获得了Notch与γ分泌酶在一起的状态，这时已经快到春节了。
我们立即收了一些数据，春节在家远程计算，大年初三早上我算出来一个初步结果，发现我们想要的底物确实存在。很兴奋！有一种迫不及待想把课题做出来的心情。于是我们很快回到实验室，准备样品，收集数据，最终把课题做了出来。
还有一个印象深刻的事情就是课题做出来后，我们从结构里发现了一个没有想象到的二级结构β-sheet的形成。如果没有结构生物学，是很难想象或者预测出来的。这也是结构生物学巨大的魅力。
Q3：如何在这么短的时间内连续在顶刊发表两篇论文？
APP和Notch对研究阿尔兹海默综合症的发病机理和治疗手段都很重要。很多药物公司投入巨资研发减少APP切割的药物，其中礼来公司的Semegacestat就是一种γ-分泌酶的抑制剂，这一款被寄予厚望的药物临床实验中确实减少了淀粉样蛋白的量，但是也增加了病人患癌的风险，原因就是药物抑制了Notch的切割。所以设计出特异性的只针对性抑制APP切割的药物非常重要，我们对这方面很感兴趣。基于此，要想更全面的解决特异性的问题，我们需要获得γ-分泌酶分别结合APP和Notch的结构。
其实两种底物的研究过程是螺旋上升的，一直同时进行。在最初的对APP的尝试中，由于APP蛋白本身的性质，我们并没有获得很大突破。随后我们比较了Notch与APP的蛋白质序列，惊奇的发现尽管二者序列各不相同，但是二级结构相似性很大。这一规律的总结带给我们突破口。我们先获得了Notch与γ-分泌酶的稳定复合物，随后在解析结构后再次对比APP与Notch的序列，确定了针对APP的方案，真是有一种柳暗花明的感觉。
此外，杨光辉就研究生科研也提出了一些自己的心得和建议。他认为做研究的目的是解释这个领域的重要的科学问题。同时他认为，要想更好地做研究，这个领域的文章一定要多读，重要的文章细读，从中多总结；同时要有批判性思维，对重要的线索要先验证，再与自己的课题相结合。在实验过程中一定要注意细节的把握，做好对照实验，要注重实验设计的逻辑。
十年求索：愈加清晰的研究视野
施一公教授2006年在清华大学建设实验室之初，就将揭示阿尔兹海默症的发病机理作为重点研究方向。此次发表的两篇研究成果是研究团队长期以来在该领域持续发力的重要结晶。在此之前，施一公教授及其所带领的团队在该领域不断突破，发表了一系列重要研究成果：
2012年12月，施一公研究组在《自然》（Nature）报道PS1细菌同源蛋白PSH的晶体结构，并根据同源性首次构建了PS1的结构模型，揭示了PS1的结构折叠，并在结构上初步分析了在阿尔兹海默症病人中发现的PS1突变位点。
2014年6月，施一公研究组与英国MRC分子生物学实验室白晓晨博士等合作在《自然》（Nature）报道了分辨率为4.5埃的γ-分泌酶复合物电镜结构，观察到了其跨膜区域呈马蹄形排布的结构。
2014年9月，施一公研究组在《美国科学院院刊》（PNAS）发表文章，报道了其中一个亚基Nicastrin同源蛋白胞外结构域的高分辨率晶体结构，推测了Nicastrin在底物招募过程中可能的机制，并且根据同源性构建了人源Nicastrin 胞外结构域的结构，结合该结构与此前解析的PSH晶体结构和4.5埃分辨率电镜结构，他们在γ-分泌酶跨膜区辨认出了PS1，并进一步推测了该复合物近20个跨膜螺旋的组装模式。
2015年3月，施一公研究组在《美国科学院院刊》（PNAS）发表论文，报道PS1的细菌同源蛋白PSH具有与γ-分泌酶类似的底物切割活性，并且其酶活也受到γ-分泌酶小分子抑制剂的抑制，并解析了该抑制剂与PSH的复合物结构，揭示了其抑制位点，从而使得PSH可以作为一个研究成本相对低廉的替代品来进行γ-分泌酶调控小分子的初步筛选。
2015年4月，施一公研究组在《美国科学院院刊》（PNAS）发表论文，报道人源γ-分泌酶4.3埃的冷冻电镜三维结构。与一年之前的4.5埃结构相比，尽管分辨率只提高0.2埃，但是跨膜区密度质量有了极大提高。此外他们在PS1的N端连接T4-溶菌酶蛋白，从而准确定位出PS1的第一个跨膜螺旋，并在此基础上判断出四个亚基，验证了在2014年PNAS文章中推测的组装方式。此外，他们利用性质非常缓和的去污剂制备样品，证明电镜观察到的结构并未因蛋白纯化和冷冻制备而受到影响。这个结构也是清华大学电镜平台的K2电子探测相机自2014年暑期正常运转之后解析出的最小分子量的结构。
2015年8月18日，施一公研究组在《自然》（Nature）在线发表了题为《人源γ-分泌酶的原子分辨率结构》（An Atomic Structure of Human γ-secretase）的文章，报道了分辨率高达3.4埃的人体γ-分泌酶的电镜结构，并且基于结构分析研究了γ-分泌酶致病突变体的功能，为理解γ-分泌酶的工作机制以及阿尔兹海默症的发病机理提供了重要基础。
2017年，施一公研究组于《美国科学院院刊》（PNAS）发表两篇文章，对γ-分泌酶上疾病相关突变切割APP的性质和机理进行了研究。
