病理实验技术

病理学技术（组织标本切片和染色技术）是组织学、病理学等学科用于观察和研究组织与细胞的正常形态及病理变化的常用方法。 

组织经过固定、切片和染色后，光波通过被检组织成分时，波长和振幅发生改变，在显微镜下能清晰的观察其组织结构，称之为光镜标本的基本制作方法或称为组织制片技术。 

目的生物学标本在生活状态下多为无色透明，而且组织一旦离开机体后很快就会死亡，其结构就会失去正常状态。必须对组织采取固定、切片和染色措施！ 

根据所使用支持物质的不同，切片方法分为：

组织切片的主要程序： 

取材、固定→脱水→透明、浸透→包埋、切片→贴片、染色→浸洗→脱水→透明→封固。 

来源：临床活体检查，手术切除，病理解剖，实验动物等 

要求：

1、根据实验目的和要求及病变程度合理取得组织材料。

2、取材的过程迅速、准确 

组织取材注意事项

固定的目的： 

1）防止标本的自溶与腐败，以保持组织细胞的固有形态。 

2）使组织细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种物质成份沉淀或凝固成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。 

3）可增强染色的作用。使组织中的各种物质沉淀凝固而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。 

4）固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，增加组织硬度，便于制片。 

5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。另外，对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。

固定的方法： 

物理方法

干燥：血涂片

高热：细菌涂片

低温骤冷

化学方法

使用化学试剂配制成固定液固定 

影响固定的因素：

1 .组织固定必须新鲜：无论取人体或动物组织，都必须立即投入固定剂。

2.防止组织因固定剂的作用而发生变形。

3.标本大小：在保证形态结构完整性的同时，厚度不超过5mm。

4.固定液的量：一般为组织块体积的20-30倍（不得少于标本体积的5倍）。

5.固定时间：根据组织的种类、大小，固定剂种类、性质、渗透力的强弱而定。

6.固定温度：室温（20-25℃）或低温（如4℃），一般不应超过40-45 ℃。

7.选择适当的固定液

8.促使固定 

注意事项：

免疫组化固定方法的原则是：在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下，应选用浓度最低的固定液和最短的固定时间。为此，固定组织时应该： 

1）组织新鲜，尽早、尽快固定。

2）组织块尽量小。

3）固定后充分水洗，减少固定液造成的人工假象。

 4）针对抗原、染色法选择最佳的固定方法 。 

常用的固定剂： 

1）10%福尔马林缓冲液（pH7.4）

2）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4）

3）Bouin液

4）Zamboni’s液 

5）丙酮 

6）95%乙醇 

​7）A-F液

定义：

利用某种化学试剂逐步将标本内部吸收的水分置换出来，以使标本处于无水状态，这一过程叫脱水。

目的和原则

1有利于标本的下一步处理，即透明、浸透、包埋

​2有利于切片的操作

3有利于标本的长久保存 

常用的脱水剂：

1.单纯脱水剂：如乙醇、丙酮和甲醇

2.脱水兼透明剂：如正丁醇、叔丁醇等

注意事项：

脱水时必须由低浓度脱水剂开始，逐步转入高浓度脱水剂，经过各级浓度的脱水剂使其所含的水分逐渐减少而代之以脱水剂。防止组织过度收缩变形，或脱水不完全而影响制片效果。

1）组织取材3mm厚度，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数小时。

2）组织流水冲洗6-12h。 

3）70％酒精2-4h。

4）80％酒精2-4h。

5）90％酒精2-4h。

6）95％酒精（Ⅰ、Ⅱ）2-4h。

7）100％酒精（Ⅰ、Ⅱ ）1-2h。

8）二甲苯（Ⅰ）5-30min。

9）(二甲苯（Ⅱ） 5-30min)。

10）浸蜡（Ⅰ、Ⅱ ）2h。

11）组织包埋 

石蜡切片法

优点:

缺点：

冰冻切片法

优点：

缺点：

染色的目的：将标本切片浸于染色剂内，经一定的时间，使组织或细胞及其他的成分被染上不同的颜色，产生不同的折射率，便于在光镜下进行观察。 

普通染色：最广泛应用的是苏木精和伊红染色，又称常规染色。

特殊染色：为显示特定的组织结构或其他的特殊成分。

复染色：衬托主染色所进行的染色。

常用的染色方法 

一）苏木精（素）：是现今最常用、最有价值的常规细胞核染色剂，习惯上称苏木精是碱性染料 

二）伊红：是一种胞浆较理想的染色剂。常用伊红Y。酸性染料组织成分呈弥漫性染色。

1） 脱蜡至水 

①二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5-10min②100%乙醇 （5～10）min×2或3次③依次95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5～10min④蒸馏水浸洗 2～5min

2）苏木精染色

① 苏木精1-10min。② 自来水流水冲洗。③ 0.5%盐酸-乙醇分色，数秒-数十秒。自来水快洗。 

④ 0.5%氨水蓝化，30sec-1min，自来水冲洗⑤ 光镜下镜检细胞核分色程度。⑥ 自来水流水冲洗3min。 

3）伊红染色 

① 1%伊红1-10min。② 蒸馏水快洗。 

脱水、透明和封固

① 70%、80%、90%乙醇速洗，每级数秒-数十秒。② 95%30sec-1min.光镜下监控细胞核与细胞质颜色对比。 ③ 100%乙醇，3-5min，2次。④ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ,各5-10min。⑤ 封片:中性树胶

组织化学（histochemistry)或细胞化学（cytochemistry）：是基于已知的化学反应，在组织或细胞原位上显示出组织或细胞中的化学物质，并研究其化学性质及功能关系的一门技术。是在形态学的基础上，研究组织或细胞中化学物质的形态、化学成分及定位、定量和代谢状态的学科。

组织化学的特征：应用物理的和化学的方法来查明细胞或组织的化学成分； 用组织学、化学、物理学原理，研究细胞或组织的结构、功能与化学的关系； 对细胞或组织成分的定位、定性、定量的特征进行研究，来认识细胞或组织结构与功能的关系。具有较强的特异性。 

为了能在完好的结构上同时显示其化学物质，组织化学技术必须做到：

（1）保存组织（细胞）在生活状态下的结构；

（2）保存组织（细胞）内的生前化学成分、酶活性及检测目的物；

（3）所使用的染色方法是按照已知的化学或物理反应原理进行。

（4）反应产物应在组织结构上形成稳定的有色沉淀物质。

（5）检测手段要有高度的敏感性、特异性和可重复性。

（6）生成物的反应产物必须在原位沉淀，保证定位的精确性及稳定性。

组织（细胞）化学基本步骤冰冻切片或石蜡切片等常规处理后，再进行组织（细胞）化学染色，在光镜下观察。 

纯化学方法：Schiff反应法、偶氮偶联法、金属沉淀法、联苯胺反应、四唑盐反应 

类化学方法：属某些特殊染色技术，如：Best洋红染色 显示糖原，Baker酸性苏木精染色 显示磷脂，Mayer黏洋红与黏苏木素 显示黏蛋白 

物理学方法：1）脂溶染色法2）荧光分析3）放射自显影 物理化学方法等

糖类物质的显示方法： 

PAS显示法（Periodic Acid Schiff） 阿利新蓝法（Alcian Blue） 阿利新蓝-PAS复合法（Alcian Blue-PAS） 胭脂卡红法（Carmine method） 甲苯胺蓝法 硫堇法等。

蛋白质显示方法：

1、pH4.2以下的酸性溶液中，用坚牢绿、溴酚蓝、丽春红-2R等酸性染料染色，出现阳性结果表明有蛋白质存在

2、在pH8.0以上的碱性溶液中，用酸性染料染色，呈阳性结果表明含碱性蛋白质

3、若第2步为阴性结果，则改在酸性溶液中用碱性染料（亚甲基蓝）染色。

核酸显示：1、显示DNA ： Feulgen法试剂：Schiff试剂、盐酸、亚硫酸氢钠 2、核仁组成区和酸性粘多糖复合显示法：试剂：2%的甲酸、2%的明胶、50%的硝酸银、阿申蓝（8GX）、醋酸溶液3、粘多糖和核仁组成区双染法试剂：Schiff氏试剂、胶性银液 4、RNA和DNA的甲绿-派若宁显示法试剂：甲绿、派若宁。 

酶组织（细胞）化学：用组织（细胞）化学方法显示酶在组织或细胞内的定位的技术。

常用的方法：酸性磷酸酶  碱性磷酸酶  三磷酸腺苷酶  乙酰胆碱酯酶  细胞色素氧化酶 一氧化氮合酶

影响酶活性的因素： 

1 、温度：大部分酶反应的合适温度为37℃。

2、 pH： 酶有适合酶反应速度的pH(大部分为7.0) 

3、抑制剂 能使酶活性降低的物质

4、激活剂 能使酶活性增高的化学物质

5、底物浓度对酶反应速度的影响