自2000年起，大环内酯类耐药Mp在全球各地流行的证据越来越多[6]，对临床抗菌治疗造成一定的影响。中国、日本等国家报道的部分地区Mp耐药率已达到90%~100%[7]。重症Mp肺炎治疗挑战性大，需要早诊断、早治疗，实验室病原学诊断是Mp感染诊断的关键。由于Mp的特殊病原学特征，实验室检测方法多样，为规范儿童Mp呼吸道感染实验室诊断程序，提高诊断效率，经中华医学会儿科学会临床检验学组专家讨论，达成并制订儿童Mp呼吸道感染实验室诊断专家共识。
Mp属于柔膜体纲，支原体属，是能够进行自我复制的、有能力在体外不依靠活体细胞而生存的最小微生物[1]。Mp直径125~150 nm，长约1~2 μm，无细胞壁，仅有细胞膜，革兰染色阴性。因无细胞壁，Mp呈多形性，其细胞体积小于典型细菌体积的5%，能够通过0.45 μm孔径的细菌滤器，在营养丰富的固体培养基（如SP4培养基）上生长，显微镜下能够看到Mp的典型菌落。Mp的基因组长度约800 000 bp[8]，包含大约700个蛋白编码基因和一些非编码DNA序列。核糖体由30S和50S亚基组成，其基因组为环状双股DNA，分子量约5×108[9]。Mp较小的基因组长度以及有限的生物合成能力限制了其生物合成和代谢能力，需要复杂的培养基添加成分才能在体外进行分离培养[10]。Mp生长缓慢，以二分裂方式繁殖，每6 h进行一次分裂，有时需要经过长达数周的生长和（或）多次传代才能获得阳性菌株。
Mp的检测方法主要分病原学检测和血清学检测两大类，需掌握不同检测方法的特点，依据不同需求和目的选择不同方法。
一、病原学检测
（一）培养法
获取合格的呼吸道标本，用特殊的液体培养基进行3~7 d培养，培养基变色后转入固体培养基继续培养至镜下见到Mp典型菌落或经基因、生化鉴定后判断为Mp阳性。Mp菌株生长缓慢，需要经过多次传代培养才出现阳性反应，敏感度为34.78%，Mp培养阳性的诊断特异度接近100%[11]，并能对分离株进行种属鉴定、分型及药敏实验，具有重要的临床意义。Mp专用培养基中必须含有葡萄糖作为代谢底物，同时还应包括血清（作为胆固醇来源）、酵母提取物以及pH显色剂。推荐使用SP4肉汤及琼脂培养基进行传统法Mp培养。
目前有基于培养方法的快速检测试剂盒，其方法原理是Mp利用试剂中的高营养和快速生长因子迅速增殖，产酸使试剂pH值降低，通过指示剂颜色变化来判断Mp的存在，或进行药敏分析。快速培养Mp出现阳性结果的时间较短，6~90 h不等，与Mp生长传代时间不符。有学者质疑这种快速培养法的特异性，认为导致培养基快速出现阳性变色的原因是其他微生物污染而出现的假阳性。如：患者带菌或在标本采集、运输、接种等过程出现细菌或真菌污染，而培养基中相应抗菌素用量不足或含量不均匀也是导致细菌污染发生的因素。另外，口腔酸碱度的影响，如食物残渣、酸性饮料等，培养操作过程中使用的材料、环境的酸碱度均能改变培养基的颜色。对临床高度怀疑Mp感染患儿的标本，72 h培养阴性者建议继续观察至7 d[12]，快速培养阳性应采用分子生物学方法进行病原学诊断确证。
（二）肺炎支原体的直接检测
采用免疫双抗夹心的方法[13]，取患者呼吸道拭子或吸取物，采用荧光、量子点、胶体金等标记的鼠抗人Mp单克隆抗体，异硫氰酸荧光素或显色物标记的羊抗鼠抗体IgG来检测Mp抗原，在荧光显微镜下观察被特异性荧光标记的Mp活跃性或肉眼看到颜色条带来判断是否感染。目前多利用高特异性地识别Mp的黏附相关P1蛋白单克隆抗体直接检测Mp抗原，有报道特异度和敏感度为100%和97.4%[13]。此类方法方便快捷，但易受人为因素干扰，如未取到感染细胞、没有选中合适的视野或其他病原及自身的交叉抗体干扰等，均会影响结果。
（三）分子生物学
分子生物学检测主要有DNA和RNA检测两大类。该类方法具有高特异性、检测速度快、样本周转时间短的优点，为临床诊治提供明确依据。
1．DNA检测技术：
基于DNA检测技术的方法众多，主要有荧光定量PCR和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）两种，其检测样本为痰、鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液，检测靶标为Mp-DNA，根据P1蛋白、16S rRNA等目标基因设计扩增引物。以DNA为靶标的检测技术灵敏度和特异性都能满足临床需求。但是Mp死亡后其DNA仍可存在于部分患者体内，时间达7周~7个月，且不易降解，导致DNA检验结果不能很好地用于治疗效果的评估。
2．RNA检测技术：
RNA检测技术是基于核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种核酸检测方法，简称实时荧光恒温扩增技术（simultaneous amplification and testing，SAT）。其采用的靶标为16S rRNA，在Mp中以多拷贝形式存在（多达104拷贝量），其灵敏度和准确性与DNA检测方法相比都有很大提高[14]。由于RNA随病原体死亡而降解，可作为评价Mp感染转归、药物疗效的指标，其检测结果与Mp的感染严重程度相关性较好，因此Mp的RNA检测是目前早期快速诊断、判断疗效的最好方法之一[15]。
对于上述病原学检测的方法，均需检测人员严格掌握检验前质量，尤其是标本采集、运输、保存、接种、培养方法及操作过程的规范，以期获得最准确检测结果。
二、血清学检测
通常情况下，人体感染Mp后能产生IgM、IgA、IgG类抗体。IgM抗体一般在初次感染1周内开始升高，2~3周达到高峰，4周时下降，2~3月降至最低[16]。IgA抗体在Mp感染早期迅速上升，由IgM型转换产生，7~14 d至峰值水平，回落比IgM或IgG更早。IgA抗体变化与IgM一致，成人Mp感染IgA阳性率高，与IgM检测相比，儿童IgA检出率较低[17,18]。IgG较IgM和IgA出现晚，一般于感染后14 d左右出现，浓度峰值一般在感染后的第5周，具有较长的维持时间[20]。
与病原学检测方法比较，抗体产生有时间窗和个体差异，但抗体检测结果不受抗生素治疗的影响。临床上Mp血清学诊断常用方法有酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、颗粒凝集法（particle agglutination，PA）、免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique，GICT）、化学发光法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）、间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay，IFA）。用于抗体检测试剂的Mp抗原选择非常重要，它决定了检测的敏感度和特异度。目前主要有4大类抗原，Mp全细胞裂解物（全菌体抗原）、蛋白提取物、膜制备物、糖脂提取物。Mp全菌体抗原包括细胞膜的糖脂、蛋白质等成分，特异度和敏感度较差，与人体多种组织细胞膜、某些细菌（如流感嗜血杆菌、奈瑟脑膜炎球菌等）以及其他支原体都会出现非特异性交叉反应；黏附相关蛋白，如P1蛋白、P30蛋白、P116蛋白、重组AtpD蛋白、重组P1-C蛋白等是重要的免疫原，尤其P1蛋白，能刺激机体产生较强烈的免疫应答，是Mp诊断的重要抗原，重组P1蛋白的特异度和敏感度可以达到97.7%和85.0%[16]。
下面介绍各类血清学检测方法的特点。
（一）ELISA
ELISA作为实验室常用的双抗体夹心法，利用其基本原理检测人血清中Mp的IgM、IgG、IgA各类型抗体，具有较高的敏感度和特异度，其包被的Mp抗原来源多样，建议选择敏感度和特异度均较高的抗原包被试剂盒检测。
（二）PA
PA的原理是将Mp细胞膜（可溶性抗原）致敏或吸附在一定大小的颗粒状载体的表面，与人血清中存在的Mp抗体结合后，在有电介质存在的适宜条件下，可发生凝集，称为间接凝集反应。目前常用作载体的颗粒或微球多为人工合成或天然高分子材料制成的，如明胶颗粒、聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，产生肉眼可见的凝集反应。该方法检测有效性的指标是试剂盒内提供的阳性对照滴度达到1∶320，抗体滴度检测范围为1∶40~1∶10 240。患者血清Mp抗体滴度≥1∶160作为Mp近期或急性感染的诊断标准；恢复期和急性期Mp抗体滴度呈4倍及以上增高或减低时，可确诊Mp感染[18,20]。PA检测Mp总抗体，方法重复性好，特异度、敏感度佳，治疗前后双份血清滴度的变化更有利于诊断。
（三）GICT
GICT是一种以新型的免疫标记——胶体金作为示踪标志物，应用抗原抗体特异性结合的免疫反应原理检测Mp抗体，主要有免疫层析法和免疫渗滤法。基本原理是反应板上的Mp抗原可与待测样本中Mp抗体结合，再与胶体金标记的抗人IgM抗体结合并显色，形成肉眼可见的红色斑点或条带判断阳性。GICT检测Mp的IgM抗体，研究显示儿童MP-IgM阳性与PA滴度1∶160和≥1∶320的符合率均为95%；单次测定Mp-IgM阳性对诊断儿童Mp近期感染有价值，适合门诊的快速检测[21]。目前是定性试验，患者抗体含量较低时可能造成漏检，且抗体在部分治愈患者体内持续存在，使得对短期内再次感染的阳性判断造成困扰。
（四）CLIA
CLIA的原理是将发光物质直接标记在Mp抗原上，或免疫复合物上的酶作用于发光底物，通过大型发光仪测量光量子产额，定量、成批地检测Mp的IgM、IgG，目前此方法的应用、与常用抗体检测方法的比对研究较少，需进一步积累数据。
（五）IFA
IFA的原理是用标本血清和已知的Mp抗原相互作用，经温育后洗涤。若待检测标本中含有相应抗体，则与Mp抗原发生特异性结合且不会被洗掉，与标记有荧光素的抗球蛋白抗体结合，在显微镜下观察绿色荧光。该方法主要检测Mp IgM抗体，特异度和敏感度较好，具有对照明显、结果判读和操作简单等优点[16]。但该实验易受人为判断荧光结果影响，包被抗原含量不足可能会产生假阴性，体内含有类风湿因子、多种自身免疫性抗体等与包被抗原有交叉反应可能出现假阳性。
（六）补体结合试验（complement fixation assay，CFA）
CFA的原理是利用Mp抗原抗体反应消耗补体从而使补体参与指示系统的抗原抗体反应的浓度降低或消失。CFA检测抗Mp的总抗体，一般认为滴度>1∶64或恢复期血清呈4倍以上升高有诊断意义。与其他检测方法相比，CFA采用糖脂抗原，特异性较差，操作过程中存在较多干扰，目前已经很少用于Mp临床诊断。
（七）冷凝集试验（cold agalutination test，CAT）
多年前CAT应用于Mp感染的实验室诊断，血清冷凝集素在感染1周开始升高，4周达高峰，第6周下降或者消失，红细胞CAT阳性，效价大于1∶32，恢复期效价增加4倍有诊断意义。但冷凝集素增高也可见于其他疾病，如流行性感冒、传染性单核细胞增多症、风疹等，故CAT的特异性差，现已逐渐被其他Mp的检测方法取代。
（八）实验室Mp血清学检测结果的判读
1．颗粒凝集试验抗体滴度≥1∶160：
提示近期或现症感染。
2．只有IgM抗体（+）：
提示近期感染。
3．只有IgM及IgA（+）：
提示现症感染。
4．只有IgG抗体（+）：
提示既往感染。
5．IgM、IgG及lgA均为（+）/IgM及IgG（+）/lgA及lgG（+）：
提示现症感染或近期感染。
6．间隔2~4周双份血清抗体亚型转化/血清抗体水平4倍及以上增加或降低：
确诊Mp感染。
评价血清学检测结果时需要结合患者的临床病程、基础状况以及年龄等因素综合考虑，如：免疫功能低下、缺陷的人群、产生抗体能力较低的婴幼儿，可能不产生或产生低滴度的抗体[22,23]。抗体在部分治愈患者体内会持续阳性，期间再次感染的确诊应做Mp的抗体滴度或RNA检测以佐证。
三、药敏试验和耐药基因检测
因Mp培养条件要求苛刻，生长缓慢，不推荐临床实验室常规做体外药物敏感性试验。美国临床与实验室标准委员会（CLSI）2011年颁布了支原体体外药敏测定即M43-A指南9，可用于Mp耐药流行病学调查和分析[24]。指南推荐微量稀释法测定Mp最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），其敏感/耐药的判断标准（MIC值）：左氧氟沙星≤1 mg/L，莫西沙星、红霉素及阿奇霉素≤0.5 mg/ L，四环素≤2 mg/L为敏感；红霉素及阿奇霉素>1 mg/L为耐药[10]，质控菌株为肺炎支原体FH（ATCC15531）。
Mp重症感染合并多种肺外并发症且药物治疗不佳的病例报道日渐增多。有研究显示，23S rRNA结构域Ⅱ区和Ⅴ区基因位点突变可导致抗生素与核糖体亲和力下降而引起耐药，基因突变导致的药物结合靶点改变是Mp对大环内酯类耐药的最重要原因[25]，结构域Ⅴ区A2063G、A2064G突变导致高水平耐药，A2067G、C2617G突变发生低水平耐药[26]。临床上可以参考Mp 23S rRNA基因突变位点进行耐药分析[27]。
四、肺炎支原体检测的质量控制
Mp检测的质量控制是获得准确可靠结果的前提，检验的质量控制从检验前、中、后质量控制三部分阐述。
（一）检验前质量控制
检验前质量控制主要是样本采集、运输、保存过程的质量控制和标准化，应作为重点培训和规范内容推广。
病原学检测标本采集尽可能采集多种类型的标本和（或）连续多个时间点采集不同部位的标本，以满足最低检测阈值采集量、阳性率和多种检测方法联合检测的需求。咽、鼻、喉拭子最易获得，痰液需判断是否合格，肺泡灌洗液的杂菌污染较少，不同标本的病原学检测灵敏度和特异性研究报道不一致，40%~80%不等[28,29]，晨痰对呼吸道支原体的检测价值较高，可依据临床实际情况选择，具体操作规范见表1。用做核酸检测的样本容器不可含核酸酶，以防止核酸降解；容器内应预装具有防核酸降解功能的保存液，有利于标本保存和转运。呼吸道标本室温下30 min内送检，4 ℃环境下2~4 h内送检，标本4 ℃保存不应超过48 h，预计延迟送检的标本应在－70 ℃条件下保存[30]。血液应尽可能采集急性期和至少间隔2周的恢复期双份血清。
表1 样本采集、运输、保存规范表
（二）检验中质量控制
检验中质量控制主要包括检测方法的选择、性能验证、室内质控、室间质评四方面。
1．检测方法的选择：
鉴于Mp独特的病原学特点、病原学检测的合格取材问题、血清学检测的时间窗和机体免疫条件影响以及不同检测方法的敏感度、特异度的不同，采用一种检测方法无法达到最终确诊，因此病原学与血清学联合诊断仍然是目前提倡的Mp感染诊断策略[11]。本共识给出分等级推荐的检测方法，应用时可根据实验方法学的优劣势、贡献度和实验室能力选择。
一级推荐方法：Mp病原学采用分子生物学RNA检测；Mp血清学检测方法采用颗粒凝集法抗体滴度测定。
二级推荐方法：Mp病原学采用分子生物学DNA检测；Mp血清学检测方法采用ELISA抗体分型检测。
三级推荐方法：Mp病原学采用培养法或直接检测法；Mp血清学检测方法采用间接免疫荧光法、免疫胶体金法；非特异性血清学检测方法。
一级为最佳方法，阳性可确诊Mp感染，三级推荐方法中的Mp直接检测法和GICT对门急诊患者Mp感染诊断的快速初筛是有价值的，进一步诊断需一级、二级推荐方法的确认或动态复检。建议有能力的实验室开展一级、二级推荐方法，病原学培养法虽不作为常规临床诊断推荐方法，但其真阳性可确诊Mp感染，分离株对进行种属鉴定、耐药基因检测及药敏实验具有重要的临床意义。CLIA因应用不广泛，暂不列入推荐等级。
目前国内关于Mp检测的各类试剂盒生产厂家众多，抗原、抗体选择不同，方法的敏感度和特异度不同，使判断结果存在差异，因此实验室应至少开展两种及以上不同的检测方法以弥补相互之不足，并且同一类检测方法应进行两种及以上试剂的比对试验，选取结果更好的作为最终使用试剂。
2．检测方法的性能验证：
Mp的实验室检测项目均需开展性能验证，即是检测结果准确可靠的保证，也是ISO15189对临床实验室的要求。血清学项目的检测应按照定性检测项目的性能验证指南进行，分子诊断方法的检测按照分子生物学检测方法的性能验证指南进行。
3．室内质控和室间质评：
按照ISO15189对临床实验室的要求，Mp所有检测项目需要开展室内质控和室间质评。
室内质控物的选择：阴、阳性质控物为外部对照，用于监控实验的有效性，实验室在选择时应考虑类型（宜选择人血清基质，避免工程菌或动物源性等的基质）、浓度（弱阳性质控物浓度宜在2~4倍临界值左右，阴性质控物浓度宜在0.5倍临界值左右）、稳定性（宜选择生产者声明在一定保存条件下2~8 ℃或-20 ℃以下，有效期为6个月以上）、均一性。
室内质控频率：每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控物进行质控。
室内质控物位置：不能固定而应随机放置且应覆盖检测孔位（标本间隔）。
室内质控评定规则：肉眼判断：阴性、阳性质控物的检测结果分别为阴性、阳性即在控；滴度判断：阴性质控物必须阴性，阳性质控物结果在上下1个滴度内为在控。
判断规则：根据不同项目可以采用肉眼判断的规则，也可采用统计学质控规则，至少利用一个偶然误差及一个系统误差规则。
室间质评：目前，国家及省市级临检中心尚未开展针对Mp项目的室间质评计划。因此，Mp检验项目应采用实验室间比对的方式进行评价，比对实验应满足如下要求：（1）规定比对实验的选择原则；（2）样本数量：至少5份，包括阴性和阳性；（3）频率：至少每年2次；（4）判定标准：应有≥80%的结果符合要求；（5）结果不一致时，应分析不一致的原因，必要时，采取有效的纠正措施，并定期评价实验室间比对对其质量的改进作用，保留相应的记录。
（三）检验后质量控制
检验后质量控制主要是检验结果质量的保证、检验结果的报告和发布，一个实验室具备多种检验方法时，要注意报告发出时的逻辑性。当检测结果不相符时，应查找检验前、中的质量问题；排除检测导致的假阴性和假阳性后，分析如下。
1．双阳性结果：
血清学检测结果阳性，分子生物学检测结果阳性：基本可确诊为Mp感染。此类患者，发病时间多超过一周，抗体已经产生，后期进行疗效观察时可采用RNA检测。
2．单阳性结果：
血清学检测结果阴性，分子生物学检测结果阳性：基本可确诊为Mp早期感染。其一，发病时间较短，抗体尚未产生；其二，免疫系统发育不完善、免疫功能低下，未产生抗体或抗体滴度较低。抗体效价4倍变化可进一步确证Mp感染。
血清学检测结果阳性，分子生物学检测结果阴性：需依据抗体阳性类型和滴度来判断Mp的现症或既往感染，多为治疗后的既往感染。
3．双阴性结果：
血清学检测和分子生物学检测结果均阴性，Mp感染的可能性很小，需要进一步鉴别诊断时可监测抗体滴度或重新采样。
五、儿童Mp呼吸道感染实验室诊断共识的意义
本共识规范了儿童呼吸道Mp感染的实验室诊断方法的类型、概念和价值，旨在根据患者现症和既往、门诊和住院、筛查和确诊等不同的感染情况选择不同的检测方法，结合患者临床症状、体征以及胸片等其他辅助检查，同时对患者年龄、全身状况、用药、病程等综合判断，为临床Mp感染的诊断提供合理、经济、高效的参考建议。经归纳总结形成Mp实验室诊断流程图，见图1。
图1 Mp呼吸道感染实验室诊断流程图
